Список научных трудов

Гринаш М.Н., Вильде И.Ф. Синантропная флора г. Кокчетава // Экологические проблемы современного агропром-го производства. Сборник тез., докл. и выступлений участников научно-практической конференции. Обл. типография Кокчетавского ПО “Полиграфия” 1991

Гринаш М.Н.. Изучение влияния сроков сбора шишек, условий их дозревания и хранения на всхожесть семян сосны обыкновенной // Материалы юбилейной  конференции. Н. Новгород: Изд-во с-х Академии. 1998. С. 177-180.

Гринаш М.Н., Тимощенко А.С., Семихов В.Ф. Исследование аминокислотного состава семян представителей рода Pinus L. // Проблемы дендрологии на рубеже XXI века. Тез. докл. 1999. СБС России, ГБС РАН, М. С. 80-81

Новожилова О.А., Гринаш М.Н. Изменение электрофоретических свойств белков зародыша и эндосперма у Pinus sylvestris L. в процессе созревания семени // Проблемы дендрологии на рубеже XXI века. Тез. докл. 1999. СБС России, ГБС РАН, М. С. 236-237.

Гринаш М.Н., Созонова Л.И. Изучение размерных и весовых показателей семян сосен // Лесное хозяйство Нижегородской области / Сборник научных трудов по материалам научной конференции, посвящ. 200-летию Лесного департамента России. Н. Новгород: Изд-во с-х Академии. 2000. С. 97-103.

Арефьева Л.П., Семихов В.Ф., Гринаш М.Н., Новожилова О.А.. Махин П.В. Иммунохимическое исследование рода Pinus и его взаимоотношений с другими родами семейства Pinaceae Lindl // Бюл. Гл. ботан. сада. 2000. Вып. 179. С. 126-132.

Арефьева Л.П., Новожилова О.А., Семихов В.Ф., Гринаш М.Н. Полиморфизм глобулинов семян в зависимости от эколого-географических условий произрастания // Тез. докл. межд. конф. по экологич. ботан. Сыктывкар: госуниверситет. 2002

Новожилова О.А., Арефьева Л.П., Семихов В.Ф. Гринаш М.Н. Изменение белков зародыша и эндосперма при эмбриогенезе у Pinus sylvestris L. // В кн.: «Ботанические исследования в азиатской России» Материалы XI съезда РБО.// Барнаул: Алтайский гос. университет. 2003. т 2. С. 156-157                  

Новожилова О.А., Гринаш М.Н., Арефьева Л.П., Семихов В.Ф. Закономерности биосинтеза белков зародыша и эндосперма в процессе эмбриогенеза у Pinus sylvestris L. // Онтогенез. т 35, №2 2004

Семихов В.Ф., Арефьева Л.П., Новожилова О.А., Тимощенко А.С., Гринаш М.Н. Хемосистематика семейства Pinaceae // Фундаментальные проблемы ботаники и ботанич. образования: традиции и перспективы // Тез. докл. М.: Тов-во науч. Изд.КМК 2004. С.73-74.

Арефьева Л.П., Новожилова О.А., Семихов В.Ф., Гринаш М.Н. Полиморфизм белков семян Pinus sylvestris L. в зависимости от эколого-географических условий произрастания // Бюл. ГБС. Вып. 187. 2004

Гвоздева Е.В., Арефьева Л.П., Новожилова О.А., Семихов В.Ф., Гринаш М.Н. Изучение аминокислотного состава семян в связи с систематикой семейства Pinaceae Aams. // В кн. “Роль ботанических садов в сохранении биоразнообразия растительного мира азиатской России: настоящее и будущее”. Изд-во “Сибтехнорезерв”. Новосибирск 2006 с.75-77

Семихов В.Ф., Гвоздева Е.В., Бессчетнов В.П., Арефьева Л.П., Новожилова О.А., Гринаш М.Н. Аминокислотный состав семян и систематика семейства Pinaceae // Бот. Журн., 2007 г., т.92, №12

Новожилова О.А., Мишанова Е.В., Арефьева Л.П., Гринаш М.Н., Семихов В.Ф. Биохимическая характеристика белков семян представителей родов и в связи с их систематикой // Материалы международной научной конференции посвящённой 100-летию со дня рождения член-корреспондента П.И. Лапина «Проблемы современной дендрологии». (30 июня – 2 июля 2009г., Москва). М.: Товарищество научных изданий КМК. 2009. 793с.

Рысин С.Л., Плотникова Л.С., Немова Е.М., Гринаш М.Н. Мониторинг интродуцированных древесных растений на урбанизированных территориях // Мониторинг природного наследия. Сборник статей. – М.:  Т-во научных изданий КМК.  – 2009. – С.132-168.

Рысин С.Л., Плотникова Л.С., Немова Е.М., Гринаш М.Н. Мониторинг древесных растений на урбанизированных территориях и в ботанических садах // Ландшафтная архитектура в ботанических садах и дендропарках. Материалы научн. конф. 22-25 июня 2010.  – ГБС, 2010. – С. 392-396.

Ю.Е. Беляева, М.Н. Гринаш, Коллекция рода Acer L. в дендрарии ГБС РАН: состояние и перспективы // Труды Томского государственного университета – Т. 274. – Сер. Биологическая: Ботанические сады. Проблемы интродукции. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 2010. – 478с.

М.Н. Гринаш, мониторинг состояния коллекции рода ACER L. в дендрарии ГБС РАН. Древесные растения: фундаментальные и прикладные исследования. – М.: ООО «Астра-Полиграфия», 2013, Вып. 2. – 134с.

Беляева Ю.Е., Гринаш М.Н. Коллекция рода Lonicera L. в дендрарии ГБС РАН: состояние и перспективы // Особо охраняемые природные территории. Интродукция растений – 2014: материалы заочной международной научно-практической конференции (25 июня 2014г.) / Под науч. ред. В.Н. Калаева, А.А. Воронина – Воронеж: Изд-во «Роза ветров», 2014. – 341с.

Сорокин А.Н., Гринаш М.Н. Анализ таксономической принадлежности растений, упоминаемых в литературных памятниках Древней Палестины, как основа создания «библейских садов» // Перспективы развития и проблемы современной ботаники: Материалы III(V) Всероссийской молодежной конференции с участием иностранных ученых (10-14 ноября 2014 г., г. Новосибирск). Новосибирск: Изд-во «Академиздат», 2014. С. 288-289.

Баранчиков Ю.Н., Серая Л.Г., Гринаш М.Н. Все виды европейских ясеней неустойчивы к узкотелой златке Agrilus planipennis Fairmaire (Coleoptera, Buprestidae) – дальневосточному инвайдеру // Сибирский лесной журнал. 2014. № 6. С. 80–85.

Рябченко А.С.Гринаш М.Н., Дымович А.В.Серая Л.Г., Бабоша А.В. Видовое разнообразие мучнисторосяных грибов на коллекции ясеней Главного ботанического сада РАН // Журнал "Защита и карантин растений" 2016 г., № 6 С. 33-35.

Участие в конференциях за последнее время

Международный саммит мэров городов по единому управлению экологией города «2011 Gwangju Summit Office of Urban Environmental Accords» - г. Кванджу, Южная Корея.

Межрегиональная научно-практическая конференция «Малые города России как объекты архитектурного наследия». Россия, г. Кострома, 5-8 ноября 2014 г. – Рысин С.Л., Гринаш. М.Н., Кутилин В.А. (1 пленарный и 1 секционный доклад).

VII Congress on Plant Protection: Integrated Plant Protection – a Knowledge-Based Step towards Sustainable Agriculture, Forestry and Landscape Architecture November 24-28, 2014, Zlatibor, Serbia (VII Конгресс по защите растений: «Интегрированная защита растений - научно обоснованный шаг к устойчивому развитию сельского хозяйства, лесоводства и пейзажной архитектуры». Сербия, г. Златибор, 24-28 ноября 2014 г. – М.Н. Гринаш (1 стендовый доклад в соавторстве с сотрудниками Отдела защиты растений)).

Научно-практическая конференция «Древнерусское искусство в современном дизайне». Россия, г. Рязань 29-31 июля 2014 г. – М.Н. Гринаш (1 секционный доклад).



Автореферат диссертации


РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ГЛАВНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД имени Н.В. ЦИЦИНА

_____________________________________________________________________

На правах рукописи

ГРИНАШ

 Максим  Николаевич

 

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ СЕМЯН СОСЕН,  ИХ ЗНАЧЕНИЕ В СИСТЕМАТИКЕ РОДА PINUS L .

 

 

 

Специальность 03. 00. 05 – Ботаника

 

 

 

Автореферат

 диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

 

 

 

Москва – 2003

Работа выполнена в лаборатории физиологии и биохимии растений Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН и на кафедре ботаники и физиологии растений Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии.

 

Научный руководитель:                                           доктор биологических наук,

                                                                            В.Ф. Семихов

 

Научный консультант:                                             доктор биологических наук,

           профессор Л.И. Созонова

 

Официальные оппоненты:                                        доктор биологических наук,

                                                                            профессор А.П. Меликян

                                                                            кандидат биологических наук 

                                                                            М.С. Александрова

 

Ведущая организация:                                             Московский государственный

                                                                            педагогический университет,

                                                                            кафедра ботаники

 

 

         Защита диссертации состоится  “ ____ “  _____________2003 г. в 14 ч. 00 мин. на заседании  Диссертационного совета Д. 002.0.28.01 в Главном ботаническом саду им. Н.В. Цицина Российской академии наук по адресу: 127276, Россия, г. Москва, ул. Ботаническая, 4, ГБС РАН, конференц-зал лабораторного корпуса, тел./факс (095) 977-91-72.

 

         С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН.

   

Автореферат разослан “ ____ “  _____________2003 г.

 

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор биологических наук                                                        Ю.К. Виноградова


Общая характеристика диссертации

  Актуальность темы. В настоящее время морфогенез семян сосен хорошо изучен, но остаются еще неясными многие вопросы, относящиеся к процессам и срокам формирования семян у сосен, в частности, Pinus sylvestris L., являющейся одной из лесообразующих древесных пород на территории России, играющей большую роль в формировании хвойных лесов. Сведений о сроках прохождения отдельных этапов формирования семян сосны обыкновенной в Нижегородской области нам не известно. Комплексного исследования морфологических признаков зрелых семян сосен, которое позволило бы провести более полную математическую обработку материала, не проводилось.

Биохимические признаки семян сосновых изучены недостаточно полно. В особенности это касается изучения свойств белков семян как в процессе формирования зародыша, так и использования биохимических показателей в систематике рода Pinus L.Хемосистематикой разработан целый ряд критериев, используемых для разных таксономических уровней (Семихов,2002), что позволяет применить эти подходы в решении проблем систематики рода Pinus L.

В современных исследованиях уделено внимание изучению изоферментов, аминокислот, углеводов и др. Но слабо изучено формирование белков в процессе эмбриогенеза семени, иммунохимические и электрофоретические свойства белков семян. Такие исследования нужны для наиболее полной характеристики процессов формирования семени, дополняют имеющиеся данные морфологии, а их результаты совершенно необходимы и полезны для решения вопросов систематики. И, хотя систематика сосен разрабатывается давно, здесь остается много дискуссионных вопросов и данные биохимии могут помочь их разрешить.         

Цели и задачи исследований. В работе были поставлены следующие цели:

  - уточнение сроков созревания семян сосны обыкновенной в условиях Нижегородской области методами сравнительной биохимии;

            - изучение широкого спектра морфологических и биохимических признаков семян различных видов сосен и использование их при решении вопросов систематики рода Pinus L., т.е. рассмотрение этих вопросов, как с традиционных позиций, так и с позиций хемосистематики.

  В связи с поставленными целями решались следующие задачи:

1.  Изучение морфогенеза семян P.sylvestris в период формирования зародыша

2.  Изучение возможности дозревания семян P.sylvestris в шишках ранних сборов.

3.  Исследование изменений SDS–электрофоретических и иммунохимических свойств  альбуминов и глобулинов зародыша и первичного эндосперма в процессе эмбриогенеза семени P.sylvestris с привлечением материала, собранного в природных условиях.

4.  Исследование комплекса морфометрических признаков семян различных видов Pinus L.

5.  Изучение внутривидовой вариабельности у P.sylvestris с помощью SDS–электрофоретических и иммунохимических показателей.

6.    Изучение аминокислотного состава семян видов Pinus L.

7.    Исследование иммунохимических отношений между видами в роде Pinus L.

8.   Исследование иммунохимических отношений между родом Pinus и другими родами семейства Pinaceae.

Научная новизна. Впервые изучено формирование альбуминов и глобулинов в процессе эмбриогенеза семени P.sylvestris, иммунохимические и электрофоретические свойства белков семян, собранных в природных условиях. Подобные исследования проводились ранее лишь на Picea glauca Dietr. (MisraGreen, 1990, 1991). Кроме того, помимо метода электрофореза был использован иммунохимический анализ, позволяющий проследить гомологичность белков у развивающегося зародыша и эндосперма.

Исследовано 59 видов из 9 родов семейства Pinaceae Lindl. методом двойной иммунодиффузии на предметных стеклах и методом мо­дифицированного “креста” (Арефьева, и др., 1993).

 Впервые дана характеристика по аминокислотному составу, электрофоретическим и иммунохимическим свойствам белков семян представителей рода Pinus L., подтверждено обособленное положение рода в семействе Pinaceae. Обнаружены резкие иммунохимические различия между подродами Sylvestris и Strobus, сравнимые с теми, что получены для уровня родов семействаPinaceae. Впервые внутривидовая вариабельность P.sylvestris изучена с помощью электрофоретических и иммунохимических показателей. Показана возможность дозревания семян P.sylvestris в шишках на срезанных ветвях.

Исследовано 25 видов рода Pinus L. по 15 морфологическим признакам семян. По результатам морфологических исследований проведена статистическая обработка, дана комплексная оценка видов на основе расчета расстояния Махаланобиса.

По наименьшим значениям расстояний Махаланобиса при попарном сравнении видов сосен, установлена большая близость видов, относящихся к одному подроду, по сравнению с видами, относящимися к различным подродам рода Pinus L. (подрод Strobusи подрод Pinus).

Теоретическая и практическая ценность диссертации. Полученные материалы по морфологии и свойствам белков семян сосен могут быть использованы в сводках по систематике и филогении этого рода, а также в справочных пособиях по биохимии растений. Данные по формированию альбуминов и глобулинов в процессе созревания семени P.sylvestris, определению сроков формирования семян сосны обыкновенной в Нижегородской области, по аминокислотному составу могут иметь практическое значение в семеноводстве и интродукции сосен, а также в лесном хозяйстве.

Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены на заседаниях кафедры ботаники и физиологии растений и кафедры лесных культур Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии (1997-1999), на конференции, посвященной 80-летию академика И.П. Елисеева (Н. Новгород, 1998), на Международной конференции посвященной 90-летию со дня рождения члена-корреспондента РАН П.И. Лапина “Проблемы дендрологии на рубеже XXI века” (Москва, 1999) и научной конференции, посвященной 200-летию Лесного департамента России (Н. Новгород, 2000).

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 6 работ, 1 работа принята к печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы, включающего ______ наименований, и приложения. Работа изложена на ______ страницах текста, включая ____ таблиц. Приложения содержат ____ рисунков и ____ таблиц.

 

Содержание диссертации.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.1 Краткий экскурс в историю систематики рода Pinus L.

Ботаническое описание рода Pinus сделано К. Линнеем  (Linneaus, 1763).

Вклад в разрешение вопросов систематики рода внесли многие исследователи (Duhamel, 1755; Miller, 1768; Loudon, 1838;Link, 1841; Koehne, 1893;  Masters, 1904; Shaw, 1914; Pilger, 1926; Duffield, 1951; Gaussen, 1955, 1960; Правдин, 1964; Mirov, 1967; Krusmann1972; Van der Burgh, 1973; Бобров, 1978; Тахтаджян, 1978 Landry, 1974, 1978; Farjon, 1984; Козубов, Муратова, 1986; Лотова, 1987; Тарбаева, 1995, 1996; Орлова, 2000, 2001 и др.).

Из существующих ныне систем, в настоящей работе принята система E.L. Little & Critchfield (1969,1971). В этой системе род Pinus L. включает 3 подрода: Strobus (ранее Haploxylon), включает 2 секции (Strobus и Раrrуа) и 5 подсекций, Pinus (ранееDiploxylon), включает 2 секции (Pinus и Ternatae) и 9 подсекций и подрод Ducampopinusи объединяет 105-107 видов.

 

1.2 История изучения морфологии семян сосен.

Сведения о строении семян сосен постоянно приводятся в научной литературе со 2-ой половины XIX в. в связи с активным изучением таксонов голосеменных (Link, 1841; Endlicher, 1847; Gordon, 1875; Nobbe, 1876; Toubef, 1891, 1892; Турский, Яшнов, 1893; Brandis, 1907; Smal, 1913; Beissner, 1909; Clinton-Baker, 1909-1913; Sargent, 1898; Coulter and Chamberlain, 1911; Бушмен, 1902; Masters, 1904).

С указанного периода изучались: формирование семени, особенности происхождения и строения крыла у семян (Shaw,1914;Sylven , 1916), морфология семян (MiyabeKudo, 1920; DallimoreJakson, 1948; Ferre, 1941; Hough, 1936; Parde, 1935; Андреев, 1925; Вульф, 1928; Пономарев, 1937; Липа, 1939; Вольф, 1925; Колесников, 1936; Martin, 1946; Нестерович, Чеканинская, 1953;Simak, 1953; Morgenthal, 1964; Sporne, 1965; Некрасова, 1978; Robert, 1978; Robert-Passini, 1981; Грабова, 1985), их анатомия, ультраструктура (Белостоков, 1962; Заборовский, 1962; Некрасова, 1967; Донская,  Данович, 1977; Ворошилова, 1983, 1984, 1990; Ворошилова,  Васильева, 1981; Тарбаева, 1995,1997). Использовались различные методы получения фактических данных и их интерпретации (Мамаев, 1965; Черепнин, 1999; Видякин, Глотов, 1999; Видякин, 2000).

 

1.3 Формирование и сроки созревания семени  Pinus sylvestris L.

Литература по эмбриологии хвойных многочисленна, а для некоторых видов, имеются детальные морфологические описания развития семени (Романовский, 1997; Горошкевич, 1989; Минина, Ларионова, 1979; Михалевская, 1963; Некрасова, 1960; Doak, 1935 и др.).

 Процесс эмбриогенеза P.sylvestris L. разделен на 9 стадий с использованием морфолого-анатомических критериев (Донская, Данович, 1977): недифференцированный зародыш, начало дифференцировки зародыша, возникновение инициальных клеток корня и начинающееся разделение гипокотиля на сердцевину и кору, формирование прокамбиальных клеток в гипокотиле, заложение семядолей, рост семядолей, дифференцировка семядолей, интенсивный рост зародыша, покой зародыша.

Формирование зародыша многих видов сосен в различных климатических условиях происходит в течение 1,5—2 месяцев (Buchholz, 1946; Spurr, 1949; Козубов, 1974; Донская, Данович,1977; Тарбаева,1995)   

У сосны обыкновенной из различных мест обитания наблюдались сезонные различия прохождения основных этапов эмбриогенеза (Козубов, 1974; Хазова и др., 1979; Артемов, Скупченко, 1981; Третьякова, 1990; Артемов, Козубов,  1990; Донская, Данович,1977; Романовский,1997)

 

1.4 Использование биохимических признаков при изучении хвойных

Использование методов хроматографии, электрофореза, иммунохимии, аминокислотного анализа и последовательностей участков нуклеиновых кислот и др., позволило прийти к заключению, что хемосистематика и  геносистематика обеспечивают прибавление значительной части таксономически значимой информации (Пименов, 1982; Конарев, 1998; Антонов, 2000).

В настоящее время электрофоретический анализ изоферментов является общепризнанным методом для изучения генетической изменчивости и популяционной структуры видов сосен (SnyderHamaker, 1978; O Mallei et ol,1979; Bonnet-Masimber, 1979; Kieliszewska – Rokicka, 1981; Niebling et ol,1990;  Крутовский и др.1990; Семериков, 1993; Шигапов и др., 1995; Лавриненко, Лавриненко, 1997; Белоконь и др. 1998; Семкиной, 1999 и др.).

 Показана возможность использования данных по электрофорезу белков семян для решения вопросов систематики видовPinus L. и других представителей Pinaceae (Gifford, 1988; Jensen & Lixue, 1991; Schirone et al., 1991).

Многочисленными исследованиями продемонстрирована возможность применения результатов иммунохимических исследований для решения вопросов систематики различных групп растений, в том числе и сосен (Семихов, 1997Арефьева и др., 2000).

В ряде работ получена информация об изменении белкового состава зародыша и эндосперма в процессе развития и прорастания семени у представителей рода Picea (JensenBerthold, 1989; Stabel et al., 1990; Hakman et al., 1990; MisraGreen, 1991),  в которых авторы  рассматривали динамику синтеза и накопления запасных белков в ткани мегагаметофита в процессе эмбриогенеза. Для некоторых видов рода Pinus L., определено содержание общего белка в зрелом семени,  доли нерастворимых белков (кристаллоидов) и растворимых белков(Ермаков и др., 1981; Gifford, 1988; Орехова, 1998), показано что запасные белки являются существенным биохимическим маркером для таксономических исследований и наличие в роде двух подродов Haploxylonи Diploxylon (Schirone et al., 1991), рассмотрен аминокислотный состав (Семихов и др., 1997; Гринаш, 1999).

 

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

 

2.1. Материал и методика морфологических исследований

Материалом для исследования служили зрелые семена, из коллекций Сочинского ботанического сада “Белые ночи”, ГНБС (Ялта), других ботанических садов, собраны автором и получены по делектусам.

Снимали следующие показатели: длина семени без крылышка, ширина семени, толщина семени, масса семени без крылышка, толщина кожуры с матовой поверхностью, толщина кожуры. с глянцевой поверхностью, длина эндосперма, ширина эндосперма, толщина эндосперма, масса эндосперма с зародышем, длина зародыша, ширина зародыша, длина семядолей, число семядолей, масса зародыша. Общее число семян в выборке каждого из взятых видов - 30.

Статистическую обработку цифрового материала проводили по программам, разработанным на алгоритмическом языкеFortran доктором биологических наук, профессором В.П. Бессчетновым (НГСХА Н. Новгород) и адаптированным для целей нашего исследования.    Для комплексной оценки видов рода Pinus L. применен метод расчета обобщенного расстояния Махаланобиса (Булыгин, 1978; Никитин, Швиденко, 1978; Семериков, 1981; Марущак, Сабанцева, 1991).

Сбор материала для морфологических исследований по динамике развития семени P.sylvestris L. проводился в естественных насаждениях сосняка разнотравного на базе Ключищенского лесничества Нижегородской области. Шишки собирали с двух модельных деревьев сосны обыкновенной – тех же, которые использовали для биохимических исследований, в летне-осенний период в течение трех лет вегетации с 1998 по 2000г. Из каждой выборки в 2 шишки брали не менее 10 семян.

Препарирование семян для описания и снятия морфометрических показателей проводили по Р.М. Клейн, Д.Т. Клейн (1974). Процесс эмбриогенеза прослеживали по стадиям, с учетом дифференциации и размера  зародыша, суспензора и состояние эндосперма (в соответствии с Донской, Данович, 1977).

 

2.2. Материал и методика биохимических исследований

Сбор материала для исследования динамики развития семени P.sylvestris L. проводили с двух модельных деревьев сосны обыкновенной – тех же, которые использовали для морфологических исследований, в летне-осенний период, 1 раз в неделю, в течение двух лет вегетации.

В качестве контрольных были взяты образцы полностью вызревших семян, собранных в феврале 1996 и 1999гг. Из каждой выборки по 30 шишек брали не менее 600 семян. Зародыш отделяли от эндосперма и помещали в морозильную камеру.

Для изучения внутривидовой вариабельности биохимических показателей собраны семена сосны обыкновенной с  максимально широким охватом территории, в Нижегородской обл., Владимирской обл. и Мордовии  (географический аспект) и из различных типов мест произрастания сосновых насаждений (экологический аспект).

Для аминокислотного анализа семена очищали от оболочек и размалывали, навеска размолотых семян подвергалась гидролизу в 6М HCl особой чистоты при температуре 110°С в непрерывном токе аргона. Аминокислотный анализ проводился на автоматическом аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Семихов и др, 1982).

Материалом для SDS-электрофореза служили глобулины семян, которые осаждали из солерастворимой фракции сульфатом аммония при 50% насыщении. SDS –электрофорез позволяет разделять полипептиды по молекулярной массе. Электрофорез проводилися в восстановительных условиях (Новожилова и др., 1991).

Для иммунохимических исследований солерастворимую (альбумино-глобулиновую фракцию белков - АГФ) извлекали путем двукратной экстракции 1 М NaCl на фосфатном буфере (pH 7.0). Для получения антисывороток использовалась АГФ семян Рinussylvestris. Белки осаждались с помощью сульфата аммония, доведением раствора до 70% насыщения. Осадок центрифугировался и лиофильно высушивался. Препараты белка использовались для иммунизации кроликов по стандартной методике (Гаврилюк, 1973).

В работе использовали два варианта двойной иммунодиффузии по Ухтерлони (Ouchterlony, 1965, 1967): метод модифицированного “креста” (Арефьева и др., 1993) и двойной иммунодиффузии в агарозном геле в микромодификации (Гусев, Цветков, 1961).

Глава 3.  ДИНАМИКА РАЗВИТИЯ СЕМЕНИ PSYLVESTRIS L.

 

3.1. Морфогенез семян P.sylvestris L.  в период формирования зародыша

В условиях Нижегородской области продолжительность эмбриогенеза, как показали трехлетние наблюдения, немного превышала 2 месяца: с конца мая – начало июня по первую декаду августа. Несмотря на различия  в погодных условиях, особенно резкие в сезоны 1999 и 2000 гг., наблюдалась высокая степень совпадения по срокам наступления стадий формирования зародыша и эндосперма. Период оплодотворения приходился на конец мая (27-29 мая), исходя из косвенных посылок (Романовский, 1997) о том, что оплодотворение наступает через ~ 10 дней после пыления этого года.

Определены стадии формирования зародыша и соответственно семени: 1) начальная стадия развития зародыша, стадия проэмбрио - по 17 июня; 2) начало дифференциации зародыша, ранний эмбриогенез - по 29 июня; 3) стадия активного роста и дифференциации - по 1-5 августа; 4) стадия завершения процессов роста и дифференциации, переход к стадии покоя - 10-12 августа. Это позволяет провести сравнительный анализ результатов биохимических исследований свойств альбуминов и глобулинов зародыша и первичного эндосперма в процессе формирования семени P.sylvestris который приводится далее.

 

3.2. Изменение свойств альбуминов и глобулинов зародыша и первичного эндосперма в процессе формирования семени P.sylvestris.

 

3.2.1. SDS – электрофоретические свойства белков зародыша и эндосперма

Электрофорез глобулинов. Электрофоретические исследования показали, что глобулины как зародыша, так и эндосперма имеют богатый многокомпонентный спектр. В  случае  эндосперма насчитывается около 30 компонентов, а зародыша - около 40. Для глобулинов эндосперма полностью вызревшего семени характерны хорошо выраженные и четко очерченные компоненты, которые расположены по всей длине спектра от 14,4  до 94 кДа и более. Заметно выделяются группы наиболее мощных компонентов в области молекулярных масс 48-60, 37-39, 20-22 кДа. Качественный полипептидный состав глобулинов эндосперма практически сформировался к 17-23 июля. К середине августа отмечены изменения главным образом по таким компонентам как 60, 48, 39, 37, 22 и 20 кДа. По этим компонентам в процессе созревания  наблюдалось заметное возрастание их мощности.  Компоненты в области 48 и 60 кДа  очень слабо проявляются до 1 августа и четко  15 августа. Группа компонентов 20-22 кДа  также формируется четко к 15-19 августа. После 15 августа электрофоретический спектр  глобулинов оставался практически неизменным. Наиболее близко приближаются к контролю (зрелые семена) образцы 22 сентября, хотя  компоненты в диапазоне 39 и  20 - 22 кДа более мощные у глобулинов зрелого семени. Таким образом, в процессе эмбриогенеза электрофоретический спектр  глобулинов эндосперма  подвержен изменениям и формируется в основных чертах к середине августа.

Спектр глобулинов  зародыша по компонентному составу сформировался на ранних сроках наблюдения, но мощность компонентов приобрела стабильный характер к 23 июля,  т. е.  раньше, чем у эндосперма. Относительно состояния к 17 июля можно составить лишь ориентировочное представление, т.к. количество выделенного зародыша было недостаточно.  Отличия по зародышу и эндосперму состояли в том, что для глобулинов зародыша не обнаружено заметного изменения мощности компонентов в области 48-60; 37-39 и 20-22 кДа, как в случае эндосперма.

  Электрофорез альбуминов. Альбумины эндосперма, так же, как и глобулины, обладают богатым полипептидным составом. Для альбуминов эндосперма характерно наличие около 30 компонентов, а для зародыша число компонентов превышает 30. В отличие от глобулинов, альбумины как эндосперма, так и зародыша имеют три мощных компонента в области 67-94 кДа. Наиболее мощные компоненты в спектре альбуминов зародыша: 94, 80, 70, 60, 52, 48, 39, 37, 33, 27 и 20 кДа. Самый - мощный компонент с молекулярной массой 37 кДа. Относительно зародыша 17 июня трудно что-либо сказать из-за малого количества сформировавшегося зародыша. Надо отметить, что в случае альбуминов наблюдавшиеся изменения не столь рельефно выражены, как у глобулинов. Это относится как к эндосперму, так и зародышу. Изменения по основным компонентам 70, 60, 48, 46 и  27 кДа  прослеживаются, как правило, до 10 августа.

3.2.2.          Иммунохимические свойства белков зародыша и эндосперма

При рассмотрении  иммунохимических данных по определению сроков сформированности белков зародыша и эндосперма семени сосны обыкновенной учитывали  следующие показатели: присутствие или отсутствие компонентов, их конфигурацию, уменьшение диффузности, приближенность к реакции, полученной на белки эндосперма и зародыша полностью вызревшего семени.       Иммунохимические исследования показали, что солерастворимые белки зародыша обладают более богатым спектром, чем эндосперм. Для зародыша зрелого семени характерно наличие четырех компонентов: двух основных,  мощных,  ярко выраженных  и двух минорных. Для эндосперма максимально можно отметить 3 компонента. На начальных этапах формирования зародыша, стадии проэмбрио, в образцах присутствуют основные компоненты, свойственные как белкам зародыша, так и эндосперма, хотя их мощность 7 июня еще низкая, но возрастает к 14 июня. Сходство белков зародыша и эндосперма проявляется по четкому, мощному,  хорошо выраженному общему компоненту, который располагается ближе к бороздке. Кроме того, наблюдался еще общий минорный компонент. Особенно заметно это проявлялось  на образцах, начиная с 29 июля. По второму мощному основному близкому к лунке компоненту зародыша у эндосперма отмечена реакция частичной идентичности. Общий мощный компонент зародыша и эндосперма не обнаруживается на более ранних стадиях, а окончательно формируется  с 5 августа.

Следовательно,  по иммунохимическим данным спектр белков зародыша и эндосперма по основным и минорным компонентам,  был сформирован к 19 августа.

Таким образом, синтез глобулинов и альбуминов инициируется на ранних стадиях развития зародыша и постепенно накапливаются до высоких уровней в течение фазы созревания. Этот процесс  в основном завершается  к середине августа, что соответствует стадии анатомически сформированного зародыша.

Выявлена высокая степень синхронности между стадиями эмбриогенеза сосны обыкновенной и молекулярными событиями, связанными с синтезом и аккумуляцией белков в развивающемся семени.

 

 

 

 

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ СЕМЯН ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДАPINUS L  И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СИСТЕМАТИКЕ РОДА.

4.1 Морфологические признаки

Статистическая обработка полученного материала была проведена по 25 видам рода Pinus L. (табл.) (перечень снятых показателей приведен в главе 2.1.) : P. armandii Franch., Pattenuata Lemm., Pwallichiana A.B.JacksPgriffithii McCllel., P.densiflora Siebold & Zucc., Pjeffreyi Grev. & Balfex Murr., P. canariensis Sweet ex Spreng., Pcaribaea MoreletPkoraiensis Siebold &Zucc., Pcubensis Griseb., Pmonticola Dougl. & D. Don, P. ponderosa Dougl. ex Laws., P. pumila (Pall.) Regel, P. radiata D.Don, P. rigidaMill., P. sibirica Du Tour, P. strobus L., P. halepensis Mill., P. cembra L., P. echinata Mill., P. stankewiczii Sukachz., P. eldarica Medw., P. sylvestris L., P. mugo Turra, P. bancsiana Lamb.

В качестве анализируемого комплекса признаков были выбраны 15 морфометрических параметров семени, как наиболее надежные показатели таксономической идентификации (Мамаев, 1970).

Оценка достоверности полученных данных производилась по  критерию Стьюдента (t). Его табличные значения при числе степеней свободы 24 для соответствующих  уровней значимости следующие: t0,05 = 2,06; t0,01= 2,81; t0,001 = 3,75 (Зайцев, 1984). Полученные значения t значительно превышают вышеуказанные, что свидетельствует о достоверности данных, за исключением P.caribaea по признаку толщина эндосперма, где t имеет минимальное значение 1,94.

По большинству признаков точность опыта соответствует общепринятым требованиям и варьирует от 0,52 % (длина эндосперма Р. eldarica) до 4,86 % (толщина кожуры Р. bancsiana и Pradiata; масса зародыша Ppumila).

Хотя каждый из сравниваемых видов имеет свою специфику изменчивости, отмечена общая тенденция изменчивости различных признаков семян у анализируемых видов сосен. В частности, уровень изменчивости весовых показателей, таких, как масса семени без крылышка, масса эндосперма с зародышем, масса зародыша, у большинства исследуемых видов можно классифицировать как средний и повышенный, а у Р. eldarica (43,51) как высокий. Линейные параметры семени, эндосперма и длина зародыша имеют преимущественно очень низкий и низкий уровни изменчивости (по методике С.А. Мамаева, 1969).


Таблица. Обобщенные результаты статистической обработки морфометрических признаков семян 25 видов рода Pinus L.

 

пр.

Признаки

M

±m

max.

min.

Cv,%

P,%

t

ci

 

1.

Длина семени без крылышка, мм

7.59

0.12

17.30

2.20

41.12

1.63

61.19

3.12

 

2.

Ширина семени, мм

4.63

0.09

13.00

1.60

49.68

1.97

50.64

2.30

 

3.

Толщина семени, мм

3.37

0.07

8.30

1.00

54.13

2.15

46.48

1.83

 

4.

Масса семени без крылышка, мг

91.12

5.46

800.00

3.50

150.88

6.00

16.68

137.48

 

5.

Толщина кожуры с мат. пов., мкм

29.71

1.27

181.00

3.50

107.91

4.29

23.31

32.06

 

6.

Толщина кож. с глянц. пов., мкм

30.12

1.29

180.50

3.50

107.54

4.27

23.39

32.39

12

7.

Длина эндосперма, мм

6.56

0.18

108.00

3.00

70.72

2.81

35.58

4.64

 

8.

Ширина эндосперма, мм

3.38

0.06

10.50

1.50

41.50

1.65

60.62

1.40

 

9.

Толщина эндосперма, мм

2.60

0.16

71.00

0.01

154.40

6.14

16.29

4.02

 

10.

Масса эндосперма с зарод., мг

40.17

2.07

290.00

1.30

129.47

5.15

19.43

52.01

 

11.

Длина зародыша, мм

4.90

0.06

9.50

1.80

30.88

1.23

81.46

1.51

 

12.

Ширина зародыша, мм

0.96

0.01

2.70

0.40

30.41

1.21

82.73

0.29

 

13.

Длина семядолей, мм

1.37

0.02

4.00

0.30

43.52

1.73

57.81

0.60

 

14.

Число семядолей

7.78

0.09

14.00

3.00

29.08

1.16

86.53

2.26

 

15.

Масса зародыша, мг

2.77

0.10

14.00

.20

90.92

3.61

27.67

2.52


Ошибка репрезентативности выборочного среднего изменяется в  нешироком диапазоне по большинству признаков и соответствует их уровню изменчивости. Ее оценка по величине относительной ошибки (Р) свидетельствует о том, что в подавляющем большинстве случаев она не превышает 5% порог.

Анализируемые виды характеризуются неодинаковым диапазоном изменчивости по всему комплексу признаков.

Все полученные результаты свидетельствуют о различной изменчивости морфологических признаков семян видов рода PinusL. и высокой достоверности полученного статистического материала, что, по нашему мнению подтверждает специфичность анализируемых видов в принятой системе рода Pinus L. (табл.).

Достоверность полученных статистических оценок (среднее, коэффициент вариации, лимиты), выявленная статистическая неоднородность объектов обусловили возможность применения к анализируемому комплексу видов многофакторного анализа, в частности, анализа с расчетом расстояния Махаланобиса.

Сравнительный анализ и комплексная оценка статистической близости видов по расстоянию Махаланобиса производилась в пределах существующих таксономических единиц внутри рода.

Отмечено, что в большинстве случаев минимальное значение расстояния Махаланобиса  принадлежат тем парам видов, которые относятся к одному подроду.

Попарное сравнение максимальных значений расстояния Махаланобиса исследованных видов указывает на сопоставимость величины расстояний как между видами одного подрода, так и между видами, принадлежащими разным подродам (подрод Strobusи подрод Pinus).

Приведенные данные показывают, что анализ расстояния Махаланобиса для видов рода Pinus на основе биометрических признаков семян допустим в пределах действующей системы рода. Увеличение числа значимых признаков позволит получить более ценную информацию для систематики.

 

4.2 Биохимические  признаки

 

4.2.1.   Внутривидовая вариабельность биохимических показателей

Методом двойной иммунодиффузии и электрофореза изучали солерастворимые белки семян 30 популяций Pinus sylvestris. Образцы были собраны в различных экологических условиях на территории республик Мордовии, Марий-Эл, Нижегородской и Владимирской областей. При использовании метода двойной иммунодиффу­зии все исследованные образцы показали значительное сходство, т.е. значимых различий между популяциями не было обнаружено.

Исследованные образцы показали также значительное сходство по полипептидному составу глобулинов (SDS-электрофорез), имели общий характер электрофоретического профиля; число компонентов достигает 30. Обнаруженные популяционные различия проявляются лишь по отдельным компонентам. Отмечено, что популяции, приуроченные к борам на песках, имели хорошо выраженные компоненты 57, 45 и 22 кДа. По характеру электрофоретического спектра к ним близок образец по­пуляции приручейного соснового бора, однако у этого образца обнаружено отсутствие компонента 23.5 кДа. Для трех популяций, произрастающих на боло­те, характерно отсутствие компонентов 22 кДа, при этом четко выражен компо­нент 52 кДа. Полученные результаты согласуются с данными по изменению содержания свободных аминокислот в тканях и органах сосны обыкновенной в зависимости от условий аэрации ее корней на верховом болоте (Романова, Ермолаева, 1999.). Среди образ­цов из различных географических пунктов особенно выделялись два: из Вознесенского лесхоза (Нижегородская обл.) и Вязниковского лесхоза (Владимирская обл.) по хорошо выраженным компонентам: 88; 80.5; 71; 67; 57 и 55,5 кДа. У популяции из Вахтанского лесхоза (Нижегородская обл.) наиболее четко, чем у других образцов, выражен компонент 25.5 кДа, а у популяции из Андреев­ского лесхоза (Владимирская обл.) отсутствуют компоненты 52; 35.5; 29; 28 кДа.

 

4.2.2 Оценка внутриродовых отношений

а)  Оценка отношений на основе иммунохимии

Исследование внутриродовых отношений в роде Pinus свидетельствует о том, что виды относящиеся к подродам Strobus иPinus резко отличаются друг от друга по иммунохимическим признакам. Эти различия, полученные методом двойной иммунодиффузии на предметных стеклах и модифицированного "креста", столь значительны, что близки к различиям между родомPinus и другими общепринятыми родами семейства. Нами выдвигается предположение о целесообразности выделения подродаStrobus в объеме, принимаемом WCritchelfieldELittle (1971), в отдельный род в рамках подсемейства Pinoideae. Вид Р. brutiaпродемонстрировал существенные различия, не менее значимые, чем представитель секции Ternatae - Рcanariensis. В связи с этим предлагается выделить в подроде Pinus новую монотипную секцию с Pinus brutia. Подсекцию Pineae (Ppinea) в связи с ее иммунохимическим сходством с другими подсекциями секции Pinus более логично перенести из секции Ternatae в секцию Pinus. В подтверждение целесообразности разделения рода Pinus L. на два (Pinus и Strobus) приводим мнение Е.С. Чавчавадзе и А.А. Яценко-Хмелевского (1978) о том, что, хотя некоторые сосны легко скрещиваются между собой, образуя межвидовые гибриды, другие оказываются при опылении чужеродной пыльцой стерильными. Можно считать установленным, отмечают авторы, что твердые сосны (подрод Pinus) характеризуются жестким генетическим барьером, препятствующим скрещиванию с мягкими соснами (подрод Strobus).

 

б)  Характеристика аминокислотного состава

В настоящей работе пред­ставлены данные по аминокислотному составу семян пяти видов сосны (Pstrobus L., Pgriffithii MeClellandPpineaL., Pbrutia Ten., Psylvestris L.). В научной литературе по роду Pinus мы не обнаружили тако­го рода исследований. Наши исследования показали, что аминокислотный состав семян рода Pinus характеризуется исключительно высоким содержанием арги­нина (до 20.5% у Psylvestris), относительно высоким содержанием глютаминовой кислоты (до 20% у P.strobus) и исключительно низким содержанием лизина (1.8% у Psylvestris). Между видами имеются не­резко выраженные различия по содержанию в семенах таких аминокис­лот как лизин (интервал изменчивости от 1.8% у Psylvestris до 2.8% уP.griffithii), аргинин (от 19.1% у Pgriffithii, до 20.5% у Ppinea и Р. sylvestris), глютаминовой кислоты (от 18.1% у Pbrutia до 20 1% v P strobus), лейцина (от 5.9% у Pbrutia до 6.9% у Pgriffithii), но в среднем для аминокислотного состава семян исследованных видов, представ­ляющих оба подрода и 3 секции рода Pinus, характерна слабая вариа­бельность аминокислотного состава. Для большинства аминокислот эта вариабельность (V%) ниже 10%, вариабельность выше 10% отме­чается только для лизина, гистидина и изолейцина.

 

4.2.3.  Положение Pinus L. в семействе Pinaceae

Исследовали солерастворимые белки (АГФ) семян 59 видов из 9 родов семейства Pinaceae методом двойной иммунодиффузии на предметных стеклах и методом мо­дифицированного “креста” (Арефьева, и др., 1993). Исследованы представители следующих родов (по системе Krusmann,1972): Род Abies Miller(13 видов), Род Keteleeria Carr. (2 вида), Род Pseudotsuga Carr. (1 вид), РодTsuga Carr. (3 вида), Род Picea Dietr. (8 видов), Род Pseudolarix Gord. (1 вид), Род Larix Miller. (7 видов), Род Cedrus Trew. (2 вида), Род Pinus L. (22 вида).

Полученные данные показывают, что ни один из родов семейства Pinaceae не проявляет близкого иммунохимического сходства с родом Pinus (подрод Pinus), о чем свидетельствует гетерологическая реакция между основными иммунохимическими компонентами Р. sylvestris и представителей других родов. Более адекватное представление о степени иммунохимического сходства между сравниваемыми таксонами дает реакция модифицированного “креста”. В случае рода Pinus (подрод Pinus) за основные компоненты ответственны белки зародыша, а белки эндосперма в гомологичной реакции ответственны за минорные компоненты. Белки эндосперма, выполняя главным образом функции запаса азотисных веществ и физиологически наиболее важных для проростка аминокислот, в процессе эволюции более подвержены как дивергенции, так и параллельной изменчивости сходных структур в одинаковых экологических условиях. Поэтому в систематическом плане наиболее перспективны характеристики белков зародыша. Как и в реакции на предметных стеклах, в реакциях модифицированного “креста” все исследованные роды демонстрируют резкое иммунохимическое отличие от рода Pinus (Psylvestris) по основным иммунохимическим компонентам. Полное отсутствие реакции демонстрирует род Keteleeria. Относительно ближе к роду Pinus(подрод Pinus) род Tsuga, имеющий гомологию с родом Pinus по минорному компоненту.

В заключение отметим, что иммунохимические данные находятся в полном соответствии с позициями ряда авторов (Козубов, Муратова, 1986; Лотова, 1987и др.), о том, что род Pinus имеет ряд значительных отличий как в вегетативной, так и в генеративной сфере от остальных родов Pinaceae и занимает обособленное положение в семействе сосновых.

ВЫВОДЫ

1.      Трехлетнее исследование морфогенеза развивающегося семени позволило выявить сроки наступления основных стадий развития зародыша Pinus sylvestris L. в условиях Нижегородской области:

1)      начальная стадия развития зародыша, стадия проэмбрио - по 17 июня;

2)      начало дифференциации зародыша – (ранний эмбриогенез) по 29 июня;

3)      стадия активного роста и дифференциации по 1-5 августа;

4)      стадия завершения процессов роста и дифференциации, переход к стадии покоя - 10-12 августа.

2.      На основании морфологического и биохимического изучения формирующегося семени было показано, что:

а) уже на стадии проэмбрио  инициируется биосинтез белков (альбуминов и глобулинов) зародыша;

б) на протяжении всех стадий эмбриогенеза идет постепенное  накопление запасных белков, которое в основном завершается  к середине августа;

в)  отмечена высокая степень синхронности между основными стадиями эмбриогенеза и биосинтезом и аккумуляцией белков.

3.      Семена Psylvestris L. в шишках на побегах, срезанных в конце июля, дозревшие на открытом воздухе в течение последующих месяцев, способны прорастать, что согласуется с выводом 2 б.

4.      Биохимические исследования семян 30 популяций Psylvestris L.собранных в разных эколого-географических условиях, показали:

а)  высокую степень сходства по иммунохимическим данным;

б) значительное сходство по полипептидному составу глобулинов (SDS-электрофорез) в целом, с существенными различиями лишь по отдельным компонентам, обусловленными резко отличающимися эколого-географическими условиями произрастания популяций.

5.      Сравнительный анализ семян 25 видов рода Pinus L. по морфометрическим показателям, статистическая обработка и комплексная оценка данных показали следующие результаты:

а) виды рода Pinus L.  различаются между собой по ряду количественных показателей проанализированных параметров семян;

б) по наименьшим значениям расстояний Махаланобиса установлена большая взаимная близость видов внутри каждого из изученных подродов (Strobus и Pinus), по сравнению с видами, относящимися к разным подродам.         

6.      Полученные иммунохимические данные поддерживают следующие позиции относительно рода Pinus L.:

а)   род Pinus L. занимает обособленное положение  в семействе Pinaceae;

б)   значительные отличия подродов Strobus и Pinus свидетельствуют о возможности  обсуждения проблемы выделения подродаStrobus в отдельный род в рамках подсемейства Pinoideae;

в)   существенные отличия Р. brutia от других видов секции Pinus обуславливает необходимость выделения новой монотипной секции;

г)   в связи со сходством подсекции Pineae (Ppinea)  с подсекциями секции Pinus целесообразно перенесение подсекции Pineaeиз секции Ternatae в секцию Pinus.

 

 

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ. Проекты №, №   99-04-48021,

02-04-48093, МАС 03-04-06328.

 

 

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Гринаш М.Н.. Изучение влияния сроков сбора шишек, условий их дозревания и хранения на всхожесть семян сосны обыкновенной // Материалы юбилейной  конференции. Н. Новгород: Изд-во с-х Академии. 1998. С. 177-180.

Гринаш М.Н., Тимощенко А.С., Семихов В.Ф. Исследование аминокислотного состава семян представителей рода Pinus L. // Проблемы дендрологии на рубеже XXI века. Тез. докл. 1999. СБС России, ГБС РАН, М. С. 80-81.

Новожилова О.А., Гринаш М.Н. Изменение электрофоретических свойств белков зародыша и эндосперма у Pinus sylvestrisL. в процессе созревания семени // Проблемы дендрологии на рубеже XXI века. Тез. докл. 1999. СБС России, ГБС РАН, М. С. 236-237.

Гринаш М.Н., Созонова Л.И. Изучение размерных и весовых показателей семян сосен // Лесное хозяйство Нижегородской области / Сборник научных трудов по материалам научной конференции, посвящ. 200-летию Лесного департамента России. Н. Новгород: Изд-во с-х Академии. 2000. С. 97-103.

Арефьева Л.П., Семихов В.Ф., Гринаш М., Новожилова О.А., Махин П.В. Иммунохимическое исследование рода Pinus и его взаимоотношений с другими родами семейства Pinaceae Lindl. // Бюл. ГБС. 2000. Вып. 179. С. 126-132.

Арефьева Л.П., Гринаш М.Н., Новожилова О.А., Семихов В.Ф. Полиморфизм глобулинов семян в зависимости от эколого-географических условий произрастания // Тез. докл. межд. конф. по экологич. ботан. Сыктывкар: госуниверситет. 2002. с. 20-21.

Новожилова О.А., Гринаш М.Н., Арефьева Л.П., Семихов В.Ф. Закономерности биосинтеза белков зародыша и эндосперма в процессе эмбриогенеза у Pinus sylvestris L. // Онтогенез (принято в печать)